Gonzalo Jimenéz de Quesada était né vers 1509 à Cordoba ou à Grenade, en Andalousie, d'un père avocat, d'origine juive. Il avait lui-même étudié le droit à Salamanque avant de partir aux Indes en 1535, lors de l'expédition de Pedro Fernández de Lugo nommé gouverneur de la province de Santa Marta. Il avait le poste de lieutenant de gouverneur chargé de la justice.
Il fut chargé d'une expédition vers le sud de la Colombie, avec le projet de rejoindre le Pérou par l'intérieur. L'expédition partit le 5 avril 1536, avec 670 hommes et 6 bateaux qui l'accompagnait, en remontant le cours du rio Magdalena. Il était accompagné de son frère Hernán Pérez de Quesada, de Juan de San Martin, Juan del Junco, Martin Galeano et de Lázaro Fonte. L'expédition dura 2 ans, marsuée par les combats incessants contre les tribus indigènes.
Le 6 août 1538, Jimenéz de Quesad fonda la ville de Santa Fe de Bogota (actuelle Bogota). Il resta dans la région, jusqu'à l'arrivée de deux expéditions concurrentes, venues, l'une du sud avec Sebastián de Benalcázar, l'autre du Venezuela avec Nicolás de Federmán. Les trois hommes convinrent de faire décider par la Cour d'Espagne leurs prétentions territoriales respectives. Jimenéz de Quesada se rendit en Espagne, mais c'est Benalcázar qui l'emporta et qui reçut le titre de gouverneur du Popayán. Jimenéz de Quesada eut le titre honorifique de Gouverneur de l'El Dorado.
L'expédition de Jimenéz de Quesada avait été un succès sur le plan économique : 180 000 pesos d'or et 836 émeraudes. Mais seulement 178 hommes survécurent. Après le paiement du quint royal, les hommes se partagèrent 148 000 pesos d'or pur et 1455 émeraudes.
En 1569, à 60 ans, il repartit, fort de son titre, à la recherche de l'El Dorado mythique. Avec 400 hommes et 1500 auxiliaires indigènes, il parvint dans les Llanos colombiens. L'expédition fut un échec cuisant, l'un des plus désastreux de la conquista. Il revint à Bogota en décembre 1572, avec 64 survivants, et 4 auxiliaires.
Il se retira à Suesca, dans la région de Bogota, avec ce qui lui restait de sa fortune. Il mourut de la lèpre, à Mariquita, en Colombie, le 16 février 1579.
Il est l'auteur d'une chronique intitulée : Memoria de los descubridores, que entraron conmigo a descubrir y conquistar este Nuevo Reino de Granada.
