Vasco Núñez de Balboa était né en 1475, à Jerez de Los Caballeros, Province de Badajoz, en Estrémadure. Il était passé aux Indes en 1501, dans l'expédition de Rodrigo de Bastidas, avec lequel il découvrit les côtes du Venezuela et de la Colombie actuels. En 1502, il s'installa à Hispaniola, où pendant 6 ans, il eut une encomienda de peu de rapport, qui lui occasionna des dettes.
En 1508, l'exploration de la Terre Ferme, fut l'objet du partage de ces territoires en deux régions, la Nouvelle Andalousie, à l'Est du golfe d'Uraba, confiée à Alonso de Ojeda, et à son alcalde mayor, Martín Fernández de Enciso, et le Veragua, à l'Ouest du golfe d'Uraba, confiée à Diego de Nicuesa.
Ojeda, aidé de Francisco Pizarro, avait fondé dans des conditions difficiles, devant l'hostilité des indigènes, le petit établissement de San Sebastián, d'où il était parti chercher des renforts, laissant sur place, le commandement d'une cinquantaine d'hommes, à Pizarro. Enciso, vint à son secours, depuis Hispaniola, et c'est à cette occasion, que Balboa parvint dans cette région, embarqué clandestinement sur le bateau d'Enciso, avec son célèbre chien Leoncico, fuyant ses créanciers, et caché dans un tonneau. Enciso l'ayant découvert, l'admit dans la troupe, compte tenu de la connaissance qu'il avait acquise de la région, lors de son voyage avec Bastidas.
Balboa suggéra alors de déplacer les hommes de San Sebastián de l'autre côté du golfe, en fait, sur le territoire de Nicuesa, dans le Veragua. Ils y fondèrent en septembre 1510, la ville de Santa Maria la Antigua del Darién. Balboa avait alors acquis autorité et prestige sur les hommes, contrairement à Enciso aux comportements de despote. Enciso fut démis de ses fonctions, à l'occasion d'un vote qui établit une nouvelle autorité dans un cabildo abierto, selon une procédure juridique connue, utilisée en cas d'urgence. Les deux premiers alcaldes furent Martin Samudio et Vasco Núñez de Balboa. Peu après, arriva sur place un homme de Nicuesa, Rodrigo Enrique de Colmenares, qui invita Balboa et ses hommes, à se soumettre à l'autorité du gouverneur du territoire, Diego de Nicuesa.
Nicuesa lui-même arriva peu après, et les hommes de Balboa s'opposèrent à son débarquement. Il dut reprendre la mer, le 1er mars 1511, avec seulement 17 hommes et peu de vivres, dans un bateau en très mauvais état. On ne les revit jamais plus, le bateau ayant probablement coulé avec tout son équipage. Balboa obtint ainsi la charge de gouverneur du Veragua. Sa première action fut de juger Enciso, qui fut laissé en liberté à condition qu'il rentrât en Espagne.
Balboa entreprit alors la conquête de l'isthme de Panama. Il réussit, par la force ou la diplomatie, à soumettre les caciques de la région, récoltant des quantités importantes d'or, de bijoux et de pierres précieuses. Le 25 septembre 1513, il découvrit ainsi la Mer du Sud, nommée plus tard, en 1520, Océan Pacifique, par Magellan. Il découvrit la côte pacifique de l'isthme, et revint à Santa Maria la Antigua en janvier 1514.
Enciso, parvenu en Espagne, dit le plus de mal possible de Balboa, et la couronne nomma alors comme gouverneur Pedro Arias de Avila. Celui-ci partit d'Espagne à la tête de 1500 hommes et de 17 bateaux, accompagné de Gaspar de Espinosa, du même Martin Fernández de Enciso, et de Gonzalo Fernández de Oviedo. Balboa fut condamné à indemniser Enciso.
Il reçut néanmoins de titre d'Adelantado de la Mer du Sud et de gouverneur de Panamá et de Coiba. Il se heurta alors à l'hostilité du gouverneur Pedrarias Davila. En 1517 et 1518, il entreprit la préparation d'un voyage vers le sud, mais en janvier 1519, il fut arrêté sur ordre de Pedrarias Davila, jugé sommairement et décapité, le 15 janvier 1519, à Acla, en même temps que quatre de ses proches, Fernando de Argüello, Luis Botello, Hernán Muñoz et Andrés Valderrábano. Il protesta toujours de sa loyauté envers le roi d'Espagne. Sa tête fut exposée plusieurs jours sur la place d'Acla, et on ne sait pas où ses restes furent enterrés.
